分光光度计是什么？

分光光度计是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。根据电磁辐射原理，不同的物质有不同的吸收选择，即不同的吸收光谱。分光光度计已成为现代分子生物实验室的常规仪器。常用于核酸、蛋白质定量和细菌生长浓度的定量。该仪器主要由光源、单色、样品室、探测器、信号处理器、显示和存储系统组成。

许多化学物质都有颜色，一些无色化合物也可以与显色剂一起生成有色物质。实践证明，有色溶液浓度越大，颜色越深；浓度越小，颜色越浅。因此，有色溶液的浓度可以通过比较溶液的颜色深度来确定，并定量分析溶液中所含的物质。基于比较颜色深度对溶液进行定量分析的方法称为比较颜色分析。

分光光度法是定性和定量分析被测物质在特定波长或一定波长范围内的吸收度。常用的波长范围为：

(1)200～400nm紫外光区；

(2)400～760nm可见光区；

(3)2.5～25μm(波数为4000cm<-1>～400cm红外光区-1>)。

所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计（或比色度计）、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为保证测量的精度和准确性，所有仪器应按照国家计量验证程序或本附录的规定进行定期校正和验证。

包括4000波长范围~760nm可见光区和波长范围为200~400nm的紫外光区.不同的光源有其独特的发射光谱，因此可以使用不同的发光体作为仪器的光源.

钨灯发射光谱:钨灯光源发出的400~760nm波长光谱光经三棱镜折射后，可获得红橙、黄绿、靛蓝、紫色组成的连续色谱；该色谱可作为可见光分光光度计的光源.

氢灯发射光谱：氢灯发射185~400nm波长光谱可作为紫外光光度计的光源.

物质吸收光谱

如果某种物质的溶液放置在光源和棱镜之间，屏幕上显示的光谱不再是光源的光谱。它有几条暗线，即光源发射光谱中的一些波长光因溶液吸收而消失。这种被溶液吸收的光谱称为溶液的吸收光谱.

不同物质的吸收光谱不同.因此，溶液中所含的物质可以通过吸收光谱来识别.

物质吸收光谱

当光通过某种物质的溶液时，光的强度减弱.由于部分光反射或分散在溶液表面，部分光被形成溶液的物质吸收，只有部分光可以通过溶液.

入射光=反射光+分散光+吸收光+透过光

如果我们使用蒸馏水（或组成溶液的溶剂）作为"空白"因反射、分散等因素造成的入射光损失：

入射光=吸收光十透过光

分光光度计采用能产生多波长的光源，通过一系列分光装置产生特定波长的光源。测试样品后，部分光被吸收，计算样品的吸光值，从而转化为样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

当单色光辐射穿过被测物质溶液时，被测物质吸收的量与物质浓度和液层厚度（光路长度）成正比，其关系如下：

A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc

式中:A为吸光度；

I。入射单色光强度；

I单色光强度为透射；

T物质的透射率；

k摩尔吸收系数；

L对于被分析物质的光程，即比色皿的边长

c物质浓度

物质对光的选择性吸收波长和相应的吸收系数是物质的物理常数。当已知的纯物质在一定条件下的吸收系数时，可以在相同条件下将试验产品分配到溶液中，以确定其吸收程度，然后从上述公式计算试验产品中物质的含量。在可见光区域，除了某些物质吸收光外，许多物质本身并没有被吸收，但可以在一定条件下添加显色试剂或经过处理后进行测量，因此也称为颜色比较分析。由于显色影响颜色深度的因素较多，经常使用单色光纯度较差的仪器，标准产品或控制产品应同时操作。

为什么溶液有颜色，为什么颜色和浓度有关？这个问题将在下面讨论。

一、光的互补性和有色物质的显色原理

1.光的波粒二象性

光是电磁波的表现形式。光线在真空中直线传播，反射、折射、衍射、色散、干扰和偏振发生在不同的介质上。可以用波长、频率、传播速度等参数来描述，即光具有“波动性”。光的颜色由光的波长决定，人眼能感觉到的光称为可见光，波长在400~750nrn之间。红外光和紫外光除可见光外。同时，光也有“粒子性”光电效应就是一个很好的例子。光的粒子性理论认为，光是由“光子”（或称“光量子”）所组成。当辐射能量时，光以能量E的形式辐射，当光被吸收时，能量也被吸收。每一种能量的大小是hυ。光子能量与波长的关系是E=hυ=hc／λ，E是光子的能量（J：焦耳），υ为频率，h为普朗克常数(6).63×10-34J?S），c为光速，λ光的波长。因此，不同波长的光能量不同，短波能量大，长波能量小。

2.光的显色原理

如果将两种颜色的光与一定的强度比混合得到白光，则这两种颜色的光称为互补色。图1中的两种直线光是互补的颜色。如绿色和紫色是互补的颜色，黄色和蓝色是互补的颜色等。

由于溶液中有色质点（分子或离子）选择性地吸收某种颜色的光，各种溶液呈现出不同的颜色。实验证明，溶液呈现的颜色是吸收光的主要互补颜色。例如，当一束白光通过高锰酸钾溶液时，大多数绿光被选择吸收，其他光通过溶液。从互补色示意图可以看出，透光中只有紫色光，因此高锰酸钾溶液呈紫色。

二、朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律

吸收定律可以描述溶液颜色的深度和浓度之间的关系。它由朗伯定律和比尔定律组成，因此被称为朗伯比尔定律。原子吸收分光光度计也符合这一定律。

当一束强度为I的平行单色光照射到溶液中时，部分光被溶液吸收，部分光被界面散射，其余光通过溶液，如图2所示

有：I0=Ia+Ir+It

I0-入射光强度

Ia--吸收光强度

Ir--反射光强度

It--透射光强度

通常由于Ir它很小，可以忽略不计。上式可以简化为

I0=Ia+It

透射光It入射光强度I0之比为透光率或透光率，用T表示：

T=It/Ia

透光率的负对数称为吸光度、光密度或消光度，用A表示：

A=－lgT=lg1/T=lgIa/It

吸光越大，物质对光的吸收越强。透光度和吸光度都用来表示入射光的吸收程度，它们之间可以相互转换。

实验表明，当单色光通过有色溶液时，透过溶液的光强度不仅与溶液的浓度有关，还与溶液的厚度和溶液本身对光的吸收性能有关。其规则可以用以下模式表示A＝KCL式中：A（E）——吸光度(或光密度，也可以用D表示)；K——消光(吸收)系数；C——溶液浓度；L——光程，即溶液的厚度。

消光系数K是一个常数。有色溶液对一定波长（单色光）的入射光K值具有一定的值。如果溶液浓度以摩尔/升表示，溶液厚度以厘米表示，则此时的K值称为摩尔消光系数。摩尔消光系数是有色化合物的重要特征之一。显色反应的灵敏度可以根据该值的大小进行估计。

从上面的风格可以看出，当K和L不变时，光密度E与溶液浓度C成正比。也可以说，当一束单色入射光通过有色溶液并入射光时，消光系数和溶液厚度不变，吸光度A随溶液浓度而变化。

这种单色光和有色溶液之间的关系被称为朗伯比尔定律。光电比色计和分光光度计的比色分析是基于这一定律。然而，朗伯比尔定律只适用于单色光和低浓度的有色溶液。

三、应用朗伯-比尔定律

1.等吸光法

从朗伯比耳定律可以看出，当同一光源照射同一物质的不同浓度溶液时，如果吸光度相等，则两种溶液的浓度和透光层厚度的乘积也相等。利用这种关系，可以在可见光区找到待测溶液的浓度（视觉色法）。

2．计算法

根据测量溶液浓度的一般范围，首先制备已知浓度的标准溶液。用同样的方法处理标准溶液和测量溶液，在相同的实验条件下用相同的仪器测量其吸光度。

标准溶液：As=KsCsLs

待测溶液：Ax=KxCxLx

如果在测量时选择相同厚度的比色皿使L相等，并使用相同波长的单色光来保持相同的温度，则K也相等。除去两种类型As/Ax=Cs/Cx

由此可见，在满足上述条件下，吸光度与溶液成正比。如果设计仪器可以测量吸光度A值，则可以在测量溶液浓度后找到Cx=Ax/As?Cs

由于仪器的性能和实验环境不断变化，在采用计算方法时，必须每次测量标准液和测量液，然后使用上公式计算，否则会带来较大的测量误差。

由于一般光电比色计在结构上偏离了朗伯一比耳定律，因此经常采用标准曲线法获得更准确的结果。

3.标准曲线法

该方法分为以下步骤：

(1)先准备五种以上标准浓度的溶液。

(2)测量每种溶液的吸光度A。

（3）做A～C如图3所示，标准曲线图。

溶液可以用标准的工作曲线来测量。在相同的条件下，用仪器测量A后，检查标准曲线以获得测量溶液的浓度值Cx。

由于光电比色计工作在可见光区域，仅适用于在有限波长下测量，且波长的半宽度较大。因此，它不能满足不同分析工作的需要。其次，光电比色计的灵敏度也较低。为了克服上述缺点，开发了一种更好的性能分析方法：紫外分光光度法。采用单色光纯度高，波长范围宽，可连续变化，解决光电比色计存在的问题。